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浅谈寡聚核酸药物的化学合成与“磷试剂”

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  • 作者:昊帆研发部
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  • 发布时间:2021-04-29 13:24
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【概要描述】随着核酸药物研究的日益增长,将各种各样的寡聚核酸药物进行大规模生产将逐渐成为未来的趋势,其中化学合成法是合成短链的寡聚核酸的主要方法。

浅谈寡聚核酸药物的化学合成与“磷试剂”

【概要描述】随着核酸药物研究的日益增长,将各种各样的寡聚核酸药物进行大规模生产将逐渐成为未来的趋势,其中化学合成法是合成短链的寡聚核酸的主要方法。

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近年核酸药物领域引发了较多关注。核酸药物获批上市的速度呈加速趋势,多款有潜力成为重磅炸弹的核酸药物公布了临床数据,覆盖了心脏与代谢性疾病、肝脏疾病以及多种罕见病等领域。目前全球已有13款核酸药物获批,2种mRNA疫苗获得FDA的EUA,众多核酸药物在临床试验中,随着技术的不断改进,核酸药物有望成为继小分子化药和抗体药物后的第三大类型药物。

 

相对于小分子化药和抗体药物,核酸药物拥有独特的优势。传统的小分子化药和抗体药物多是通过与靶点蛋白结合发挥作用,但是二者的研发受到靶点蛋白可成药性(druggable)的限制。据Nature报道,人类基因组编码的大约20,000种蛋白质中,仅有3,000种是可成药的,且目前只有700种有相应的药物研发出来。另外抗体药物通常只能针对细胞膜和细胞外蛋白发挥作用。而核酸类药物是通过与蛋白质表达相关的基因进行调节,对细胞内外和细胞膜蛋白均可发挥调节作用。多数核酸类药物的作用基础是碱基互补配对原则,只需知道靶基因的碱基序列,核酸药物的序列设计就较为容易。近年来随着核酸药物递送研究的进步,核酸药物再次焕发了新的生机(表1)。遥想二十年前,小分子化学药还是药物研发的主体,如今格局已经演变成小分子与抗体分庭抗礼。再经过十几年的发展,药物研发的格局有望会呈现小分子、抗体和核酸三足鼎立的局面。

 

表1 核酸药物的类型和特征

 

随着核酸药物研究的日益增长,将各种各样的寡聚核酸药物进行大规模生产将逐渐成为未来的趋势,其中化学合成法是合成短链的寡聚核酸的主要方法。化学合成寡聚核酸的方法历经了半个多世纪的发展,其演变历程从最初的磷酸二酯法,到磷酸三酯法、氢磷酸法,再到目前比较成熟亚磷酰胺法。与多肽的合成类似,寡聚核酸的合成法还可以从另外一个角度分为液相合成法与固相合成法。本文将对寡聚核酸的几种主要的化学合成法做一个简单介绍,并着重介绍最常用的“磷试剂”及其在核苷单体合成中的应用。

 

磷酸二酯法

在二十世纪五十年代早期,寡聚核酸的化学合成最先使用的是磷酸二酯法[1]。这种方法主导核酸合成十几年,一直到60年代后半期被磷酸三酯法逐渐取代。Khorana报道利用DCC或者对甲苯磺酰氯作为缩合剂,将核苷酸与另一分子核苷的羟基进行缩合得到寡聚核苷酸(图1)[2-4]。在运用该法的时候,糖环和碱基上的活性部位用保护基进行了保护,但是磷酸基却没有加以保护,使得剩下的一个磷酸键仍然有进一步参与反应的活性。随着链的延长,副反应越来越多,导致反应的产率急速下降[5]。另外一方面,由于磷酸键的存在,原料和产物的极性都很大,给后续纯化工作带来了极大的困难。因此磷酸二酯法在1970年以后就逐渐被放弃使用了。

图1 磷酸二酯法合成二聚核苷酸

 

磷酸三酯法

在磷酸二酯法的问题日益突出后,科学家们开始寻求合适的保护基对支链磷酸基进行保护,以便减少副反应,同时改变核苷酸分子的极性和溶解性,为后续硅胶柱层析纯化带来便利。因此,从上世纪六十年代后半段开始,磷酸三酯法逐渐发展起来[6,7]

 

在磷酸的保护基上,人们常用的包括:2-氰基乙基、2,2,2-三氯乙基、苯基等(图2)。例如, Letsinger使用2-氰基乙基保护磷酸键先后开展了寡聚核酸的固相和液相合成[8-10]。与此同时, Eckstein和Rizk使用2,2,2-三氯乙基保护磷酸基进行核苷酸的合成[11-13];Reese报道了利用芳香基保护磷酸基来合成核酸[14]

 

图2 磷酸三酯法合成二聚核苷酸

 

除了选择合适的保护基团对磷酸键进行保护外,理想缩合剂的发掘也是另外一大进步。虽然在磷酸二酯法中使用的苯磺酰氯仍然适用于磷酸三酯法的合成,但是一些芳香磺酰氮杂环类缩合剂有更好的缩合效率(图3)[15-18]。其中以均三甲苯磺酰基-3-硝基三唑(MSNT)缩合效率最髙,使用最广泛[19]。运用磷酸三酯法,研究人员们合成了一系列长达10-15mer的寡脱氧核糖核酸[20-23],并且这些寡核酸链采用酶催化连接的方法,得到了对应于人胰岛素基因序列的A链和B链,并成功表达[24]

 

图3 磷酸三酯法常用的缩合剂

 

氢磷酸酯法

氢磷酸法的核酸合成是在二十世纪五十年代由Todd课题组首先报道[25-27]。与磷酸三酯法不同的是,该方法不再需要额外的保护基来保护磷酸,因为氢就可以作为保护基[28]。相对于磷酸三酯而言,氢磷酸法中的磷反应活性更高,缩合时间更快,氢磷酸核苷单体更容易合成。与此同时,氢磷酸核苷单体在溶液中容易水解,不易保存,曾经很长一段时间主要用于固相核苷酸的合成[29]。后来Van Boom等人改良了氢磷酸法,他们发现核苷氢磷酸盐与另一分子核苷反应后立即加入芳香硫化物,可以很快生成稳定的磷酸三酯化合物(图4)[30]。改良后的氢磷酸法既保留的较高的缩合反应活性,也具备了较高的稳定性,从而使得该方法在核酸的液相合成中得到广泛使用[31,32]

 

图4 氢磷酸法合成寡聚核苷酸
 

亚磷酰胺法

1978年,Letsinger等人报道3价磷比5价磷具有更高的缩合活性[33]。他们将二氯亚磷酸酯在-78℃与核糖环3位羟基迅速反应,得到的亚磷酸二酯,然后立即与另一核苷的5位羟基发生缩合,生成亚磷酸三酯,再把3价磷氧化成5价磷得到稳定的磷酸三酯结构。由于第一步生成的亚磷酸二酯含有一个高活性的亚磷酰氯,不可避免地导致产生一些3’-3’或者5’-5’二聚体杂质。于是,在1981年Beaucage改进了上述方法,他们使用选择性更好的亚磷酰胺,先与第一个核苷的3位羟基缩合,然后再在四氮唑的活化下,与第二个核苷的5位羟基发生缩合,最后经过氧化得到磷酸三酯(图5)[34]。该方法可以有效减少3’-3’或者5’-5’二聚体杂质的产生,提高了收率和纯度。该方法被称为亚磷酰胺法[35,36]

 

图5 亚磷酰胺法合成寡聚核酸

 

由于亚磷酰胺法具有独特的优势,目前已经成为核酸固相合成的主流方法[37-39]。这种方法通过逐次将核酸单体连接起来,形成所需要的序列和长度后,通过几步脱保护反应,将寡核酸链与固相载体的连接切除,并脱除各种保护即可得到所需的核酸链(图6)。如今固相合成法合成核酸的技术已经相当成熟,已实现仪器全自动合成,为人们研究核酸和生命科学提供了巨大的便利。

 

图6 两步循环的固相合成法

 

“磷试剂”在亚磷酰胺法中的应用

 

图7 亚磷酰化试剂与活化试剂

 

在寡聚核苷酸的合成中,核苷单体的制备是必不可少的一个环节。目前,广泛用于合成各种核苷单体的亚磷酰化试剂主要有两种:一个是2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1)[40];另外一个是双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(2)(图7)[41]。2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1)是反应活性最高的一个,很容易与醇缩合,而双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(2)必须在四氮唑等弱酸性试剂的催化下现场活化,才能与醇发生缩合(图7)。从实用性的角度看, 2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1)比双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(2)价格更为昂贵。由于其活性较高,2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1)更容易变质,使用和保存都不太方便,在反应过程中也更容易引入其他杂质,导致纯度和收率不够理想。因此,目前在制备核苷单体的时候,双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(2)是更为常用的一种亚磷酰化试剂,它也经常被简称为“磷试剂”。

 

图 8 四氮唑催化的亚磷酰化反应机理

 

“磷试剂”与醇的缩合过程中,通常需要加入化学计量或者亚化学计量的活化试剂,其中最常用的活化试剂有四氮唑、4,5-二氰基咪唑以及吡啶三氟乙酸盐[42,43]。目前,四氮唑催化的“磷试剂”与醇的缩合反应机理已经研究的比较透彻[44-46]。该反应首先是“磷试剂”发生质子化,然后二异丙胺被四氮唑取代,随后四氮唑再被醇取代(图8)。其中,反应最慢的一步是二异丙胺被四氮唑取代这一步。上述三个活化试剂,四氮唑的酸性最强(pKa = 4.89)[42]与乙酸的酸性(pKa = 4.74)相当,4,5-二氰基咪唑(pKa = 5.20) [42]和吡啶三氟乙酸盐(pKa = 5.23) [42]的酸性较弱。由于核苷单体中5位羟基通常都是由酸敏感的4,4'-二甲氧基三苯基(DMT)作为保护基,在使用四氮唑的时候,可能伴随DMT保护基的脱保护的副反应。因此,有的时候二氰基咪唑(pKa = 5.20)和吡啶三氟乙酸盐(pKa = 5.23)是更为理想的一种选择。此外,Koch等人报道,使用二氰基咪唑作为活化试剂的时候,甚至只需要使用0.7倍当量的活化试剂即可实现完全转化,而超过1倍当量的活化试剂,容易导致二聚体的副产物产生[43]

 

“磷试剂”与我们

“磷试剂”是无色或淡黄色液体,沸点较高(115℃/0.6Torr)。“磷试剂”对氧气、水分都比较敏感,减压蒸馏过程中很容易变质,因而该产品的大规模生产比较棘手。同时,由于磷试剂特殊的性质,其质量检测也困难重重。对于使用者而言,在使用“磷试剂”的过程中,每次取完试剂后都应该用氩气保护,并置于干燥器中保存。这样可以延长该试剂的使用时间。本公司开展磷试剂的研发和生产已有近十年的时间,在该产品的生产、检测方面积累了大量的经验。目前我们能够以公斤级规模提供高纯度的“磷试剂”。此外,本公司也提供四氮唑、4,5-二氰基咪唑等相关产品,欢迎有需求的朋友来电垂询(表2)!

 

表2 本公司生产和销售的相关产品

 

 

 

参考文献
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