NEM在pH6.5-7.5之间与巯基反应形成稳定的硫醚键，在pH值＞7.5时，与伯胺的反应性和马来酰亚胺基水解均可发生。

A. 所需材料

1. 含有0.1M磷酸盐、0.15M氯化钠的磷酸盐缓冲盐水（PBS）；pH7.2（PBS）或其他pH为6.5-7.5的无胺缓冲液；

2. 去除多余的NEM装置，例如玻片分析仪透析盒，迷你型滑盖式透析盒或者离心脱盐柱。

B. 对蛋白质的巯基封闭作用

1. 在开启NEM前先恢复至室温，以防在瓶内凝固和水解而丧失活性；

2. 将蛋白质溶解于反应缓冲液中配成1-10mg/mL；

3. 用高纯水制备100-200mM的NEM，加入至少10倍摩尔量的NEM来封闭巯基，或者向蛋白质中加等量的NEM（例如，将2mg NEM加到1mL、2mg/mL蛋白质中）；

注：NEM需现配现用，防止水解。

4. 在室温下反应2小时；

5. 被封闭的蛋白质透析或脱盐除去NEM。

参考文献：

1. Smyth, D.G., et al. (1960). Reactions of N-ethylmaleimide. J Am Chem Soc 82:4600-4. 

2. Heitz, J.R., et al. (1968). Inactivation of yeast alcohol dehydrogenase by N-alkylmaleimides. Arch Biochem Biophys 127:627-8. 

3. Gorin, G., et al. (1966). Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Arch Biochem Biophys 115:593-7. 

4. Partis, M.D., et al. (1983). Cross-linking of protein by ω-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters. J Protein Chem 2:263-77. 

5. Brewer, C.F. and Riehmn, J.P. (1967). Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethymaleimide and proteins. Anal Biochem 18:248-55. 

6. Haugaard, N., et al. (1981). Use of N-ethylmaleimide to prevent interference by sulfhydryl reagents with the glucose oxidase assay for glucose. Anal Biochem 116:341-3.