近年来，多肽药物市场呈现出迅猛的增长态势。以替尔泊肽和司美格鲁肽为代表的多肽药物推动了生产规模扩大。然而，产量的急剧攀升也使得制造过程中的可持续性问题也更加突出。

在多肽合成中，每次偶联和脱保护时会引入大量辅助结构（如Fmoc），但这些结构并不体现在产物中。而侧链保护基团的使用更是进一步加重负担——每个侧链位点都要经历保护、维持稳定和脱保护的步骤，不仅降低效率，也伴随着废弃物的产生。

另外，脱保护时，若主链以Fmoc保护，需在酸性条件下脱除侧链保护，产生的高活性碳正离子容易与色氨酸、组氨酸等敏感氨基酸的侧链发生副反应，生成难以去除的杂质，增加后续纯化难度。因此，减少或不使用侧链保护基团，是提升多肽合成效率的关键思路之一。

最小化侧链保护工艺策略正是一种有效的方案，该策略无需保护多个侧链，也不必大量使用三氟乙酸裂解，可以通过比较温和的条件实现。目前，已在固相合成中得到Ferrazzano团队验证。

在最小保护策略中，核心挑战是偶联试剂的选择。液相合成中许多方案采用碳二亚胺类试剂。相比较而言，EDC·HCl虽具备良好水溶性，却难以与未保护的组氨酸相容——会与咪唑环发生副反应；而TBEC虽能规避组氨酸问题，却因水溶性欠佳，在液相合成中应用受限。因此，需要一种同时兼顾溶解度和氨基酸侧链活性基团的偶联试剂。

Ferrazzano团队将目光投向了TBDC盐这类新型试剂（结构见图），它结合了EDC和TBEC的结构特征。研究者从溶解度、反应活性、稳定性、氨基酸侧链基团兼容性、多肽合成等方面进行了评估。

1. 溶解度

将选定的碳二亚胺以0.4 M浓度溶于特定溶剂中，室温搅拌5分钟，按完全溶解、部分溶解、不溶解记录。结果显示（见下图），TBEC可溶于除水之外的所有测试溶剂；TBDC盐中TBDC·TsOH溶解度最好，可溶于所有测试溶剂；EDC·HCl则溶解度有限。

2. 反应性能和稳定性

除溶解度外，反应活性与消旋控制也是关键。实验表明，TBDC游离碱形式不能发生反应。其盐酸盐和对甲苯磺酸盐可实现完全转化，消旋程度与TBEC相当，且始终低于EDC·HCl（见下图）。

此外，TBDC盐在结构稳定性上还有一定的优势：EDC在溶液中易发生部分环化（可通过季铵盐的形式抑制环化活性），TBDC盐因叔丁基的位阻效应，环化途径被完全抑制，只以线性的活性形式存在。

3. 侧链活性基团兼容性

在多肽合成中，氨基酸侧链活性基团易引发副反应。在Fmoc-His-OH与苯丙氨酸甲酯的偶联时，使用EDC·HCl会产生约14.4%的咪唑加合物，影响产物纯度。相同反应中，TBDC盐能有效控制加合物的生成，若采用分批添加的方式（第二份间隔一小时后加入），甚至可以完全抑制该副产物（见下图，其中3为EDC· HCl，5a为TBDC· HCl，5b为TBDC· TsOH）。此外，对于侧链未保护的色氨酸、丝氨酸、苏氨酸等氨基酸，TBDC盐也表现出良好的兼容性，反应在DMF和2-MeTHF两种溶剂中均能快速反应，且效果相似。

4. 良好的溶解性

传统液相肽合成常用二氯甲烷等氯化溶剂，有一定的健康风险，基于TBDC·TsOH优异的溶解性，为绿色溶剂的应用打开了空间。研究中采用2-甲基四氢呋喃作为主溶剂，对于溶解性较差的，加入少量DMSO即可解决，最终采用2-MeTHF:DMSO = 9:1的混合溶剂，兼顾了溶解性和反应活性。

5. 多肽合成

为检验这套方法在实际合成中的可行性，研究者选取了一条具有挑战性的七肽序列——含有组氨酸、酪氨酸、精氨酸、色氨酸等多个敏感残基，且均不进行侧链保护。实验证实，通过TBDC·TsOH和Oxyma Pure组合，以约80%的产率和＞98%的纯度顺利获得七肽。

由于最小保护策略下无需同时去除多个侧链保护基团，在裂解时不再大量使用三氟乙酸，改用商品化的HCl的乙酸溶液，在1小时内完成。

总的来说，TBDC盐的应用，助推了“最小保护”策略从理论构想推进到可操作层面。TBDC盐和Oxyma Pure组合凭借对氨基酸侧链的良好兼容性、广泛的溶剂适应性，以及温和的裂解条件等，在不降低产率和纯度的前提下，显著减少了侧链保护基团的使用，提升了原子经济性。对于探索可持续多肽生产工艺的团队而言，TBDC盐无疑是一个值得关注和评估的技术选项。

参考文献：

[1] Enhancing Atom Economy via Minimal Protection-Liquid Phase Peptide Synthesis(MP-LPPS) Using TBDC Salts/Oxyma Pure.

DOI: 10.1021/acssuschemeng.6c04338.

[2] Aqueous Solid-Phase Peptide Synthesis (ASPPS) using Standard Fmoc/tBu-Protected Amino Acids.

DOI: 10.1021/acssuschemeng.5c09191.