1. 碱催化的烯醇化反应：

羧酸活化形成的活性中间体在强碱性环境下或者α位连接强吸电子基团时，α-H易被夺取重排形成烯醇中间体。而在重新质子化的过程中是无选择性的，因此最终会形成外消旋氨基酸酯，这种消旋途径在碳二亚胺类缩合试剂介导的缩合反应中可能会形成（图1，Path A）。

2. 烯酮过渡态：

活化羧酸在碱性环境下发生消除反应，活性基团离去形成烯酮过渡态，胺进攻烯酮中间体不具备立体选择性，因此得到消旋化的多肽产物，此途径可能会出现在酰氯存在的缩合反应中（图1， Path B）。

3.  噁唑酮过渡态：

相较上述两种消旋机制，第三种消旋化产生机制则更加常见，常发生于N-酰基保护的α-氨基酸参与的缩合反应中。羧酸经活化后，在碱性环境下，酰胺键中N-H被去质子化，使得活化中间体发生分子内环化形成噁唑酮中间体，经由共轭阴离子的过渡态导致分子发生消旋，从而胺与其发生反应时，得到消旋化的多肽产物（图1, Path C）。

图1 三种消旋化途径

基于上述消旋机制分析，α-H和酰胺键的N-H是引发消旋化的关键结构要素，通过分子设计调控这些活性位点的反应性，则会很大限度的降低消旋化问题。

在多肽合成中，消旋化程度受多重因素调控，主要包括缩合试剂类型、氨基酸结构特性、碱、反应溶剂和温度等相关参数。

1. 缩合试剂：

不同的缩合试剂形成的活性中间体反应活性不尽相同，这也导致了其发生消旋化的可能性存在差异，如碳二亚胺类缩合试剂（DCC、DIC等）相较于脲正离子型（HATU、HBTU等）更容易发生消旋化。

2. 氨基酸结构特性：

不同氨基酸具有不同的化学性质和空间构型，某些氨基酸在特定的条件下更倾向于发生消旋化。除了从上述反应机制中获取的α-H和酰胺的活泼氢会对消旋化产生影响外，诸如底物的空间位阻效应：（1）α-C连接的R基团位阻越大，越容易发生消旋化;（2）丙氨酸和缬氨酸在同样环境下发生缩合反应时，缬氨酸更容易发生消旋化，约为丙氨酸的两倍。

3. 碱的影响：

缩合反应中发生消旋化的程度与碱息息相关，很多缩合剂介导的缩合反应通常需要碱的参与。研究表明，碱的空间位阻以及碱的用量均会影响消旋化程度：在同等当量下，DIPEA做碱时比TEA产生的消旋化程度更小；同为DIPEA时，所用当量越高发生消旋化的比例越大（在能促进反应的前提下所进行的测试）。

4.反应环境参数：

• 溶剂：反应中的消旋化过程通常历经的中间体是带电荷的，反应溶剂的溶剂化效应可能会起到稳定异构化中间体的作用。

• 温度：高温下会对消旋化产生一定的影响。

1. 缩合试剂优化：

前文提到了缩合试剂对消旋化的影响很大，选用合适的缩合试剂或添加剂对降低消旋化程度具有很大的帮助。针对传统碳二亚胺试剂易引发消旋化的问题，可通过引入HOBt、HOAt或Oxyma等消旋抑制试剂，有效降低消旋化问题。除此之外，采用新型的缩合试剂如赵试剂Ynamide（MYMsA、MYTsA），Oxyma系列缩合试剂（COMU等）（图2）可以降低甚至避免消旋化的发生。

图2 新型缩合试剂

2.保护基团：

氨基甲酸酯类保护基可以降低噁唑酮的形成风险，另外，有些氨基酸的侧链会影响到目标反应的进行，如组氨酸侧链的咪唑环易诱导组氨酸的消旋化，选用合适的保护基如PMBOM、NAPOM能有效避免消旋化的发生（图3）。

图3 组氨酸侧链保护基

3.反应条件：

• 碱：选用大位阻，碱性较弱的碱可以有效降低消旋化程度。

• 反应溶剂：小极性非质子溶剂可以降低消旋化问题。

• 反应温度：较低的温度通常有助于保持氨基酸的立体选择性。

4. 其他合成技术：

• 机械合成方法：采用球磨辅助在无溶剂或者很少溶剂的条件下进行反应，从而降低溶剂化效应，实现很高的反应收率和极小的消旋化问题。

• 自动化快速流动多肽合成技术（AFPS）：相较于传统的固相合成方法，反应速度更快。流速增加及反应时间的缩短可以有效降低消旋化产物

• 微波辅助合成策略：可以加快反应速率，提高反应收率，降低消旋化程度。

参考文献：

[1] Duengo, S.; Muhajir, M. I.; Maharani, R.; et al. Epimerisation in Peptide Synthesis[J]. Molecules, 2023, 28, 8017.

[2] Guo, Y. Y.; Wang, M. Y.; Gao, Y.; Liu, G. D. Recent advances in asymmetric synthesis of chiral amides and peptides: racemization-free coupling reagents[J]. Org. Biomol. Chem., 2024, 22, 4420-4435.

[3] Magano, Javier. Large-Scale Amidations in Process Chemistry: Practical Considerations for Reagent Selection and Reaction Execution[J]. Org. Process Res. Dev. 2022, 26, 1562-1689.

[4] El-Faham, A.; Albericio, F. Peptide Coupling Reagents, More than a Letter Soup[J]. Chem. Rev., 2011, 111, 6557-6602.

[5] Montalbetti, C. A. G. N.; Falque, V. Amide bond formation and peptide coupling[J]. Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852.

[6] Carpino, L. A.; Ionescu, D.; El-Faham, A. Peptide Coupling in the Presence of Highly Hindered Tertiary Amines[J]. J. Org. Chem., 1996, 61, 2460-2465.